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病毒的分离与鉴定(1)

2012-12-31 来源:读书人 
病毒的分离与分离病毒的鉴定的相关介绍。

  (一)病毒的分离

  病毒分离的一般程序是:

检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种 易感的动物→出现病状
鸡胚→病变或死亡
细胞培养→细胞病变
→鉴定病毒种型(血清学方法)

  无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚;无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10~20%悬液离心后,取上清接种;咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理,杀死杂菌。

  1.细胞培养 用分散的活细胞培养称细胞培养(Cell culture)。所用培养液是含血清(通常为胎牛血清)、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液,pH7.2~7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长,是病毒实验室的常规技术。

  原代细胞培养(Primary cell culture)用胰蛋白酶将人胚(或动物)组织分散成单细胞,加一定培养液,37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞,如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞,可用于产生病毒疫苗,如兔肾细胞生产风疹疫苗,鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗,猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养,故不便用于诊断工作。

  二倍体细胞培养(Diploid cell cultune)原代细胞只能传2-3代细胞就退化,在多数细胞退化时,少数细胞能继续传下来,且保持染色体数为二倍体,称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速,并可传50代保持二倍体特征,通常是胚胎组织的成纤维细胞(如WI-38细胞系)。二倍体细胞一经建立,应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中,大量分装安瓿贮存于液氮(-196℃)内,做为“种子”,供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗,也用于病毒的实验室诊断工作。

  传代细胞培养 (Continous cell culture)通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来(如 Hela 、Hep-2、 Vero细胞系等),染色体数为非整倍体,细胞生长迅速,可无限传代,在液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作,根据病毒对细胞的亲嗜性,选择敏感的细胞系使用。

  表23-3 病毒增殖用部分细胞系及来源

细胞系名称 来源
二倍体细胞系
HDCS
MRC-9
WI-38
传代细胞系
Hela
Hep-2
Vero
BHK
人胚肺细胞
人宫颈癌细胞
人上皮细胞
猴肾细胞
地鼠肾细胞

  淋巴细胞培养(Lymphocyte culture)正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代,这是病毒转化细胞的例证,也是分离出EBV的标志。T淋巴细胞在加入T细胞生长因子(IL-2)后可在体外培养,为研究人类逆转录病毒(HIV、HTLV)提供了条件,HIV在T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。

  2.动物试验这是最原始的病毒分离培养方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性而定,可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉,例如嗜神经病毒(脑炎病毒)接种鼠脑内,柯萨奇病毒接种乳鼠(一周龄)腹腔或脑内。接种后逐日观察实验动物发病情况,如有死亡,则取病变组织剪碎,研磨均匀,制成悬液,继续传代,并作鉴定。

  3.鸡胚培养用受精孵化的活鸡胚培养病毒比用动物更加经济简便。根据病毒的特性可分别接种在鸡胚绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、脑内或静脉内,如有病毒增殖,则鸡胚发生异常变化或羊水、尿囊液出现红细胞凝集现象,常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养;但很多病毒在鸡胚中不生长。


(作者:读书人网友 编辑:kind887)
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